本文刊登于《中国实用妇科与产科杂志》2020年1期10-15页

作者：黄荷凤，徐晨明，王璐璐

基金项目：国家重点研发计划（2017YFC1001300）；国家自然科学基金重大项目（81490742）

出生缺陷是我国乃至全球所面临的严峻挑战，指婴儿出生前发生的身体结构、功能或代谢异常，与环境、遗传因素密切相关，其中遗传因素又包括染色体异常与基因突变。罕见遗传病作为出生缺陷的重要组成部分，80%~85%具有遗传基础，且绝大多数由基因突变导致。根据世界卫生组织（WHO）的定义，罕见病为患病人数占总人口的0.65‰~1‰的疾病或病变，目前全球已知约6000～8000种，50%在出生或儿童期即发病，仅有少于6%的罕见病具备有效治疗方法，患者生存及生活质量严重受损。因人口基数庞大，中国目前预计约有2000万罕见病患者，所以罕见病在我国并不“罕见”。若要从根本上减少并防止罕见病的发生，必须进一步完善孕前遗传学咨询、产前检查与疾病筛查体系，从源头进行阻断。辅助生殖技术与遗传学诊断技术的飞速发展，为我们带来了植入前胚胎遗传学检测技术（preimplantation genetic testing，PGT），在阻断罕见病等出生缺陷的遗传中发挥着至关重要的作用。本文就PGT的发展历程及其在我国应用于阻断罕见遗传病的研究现状进行阐述。

1  PGT的定义及适应证

PGT是人类辅助生殖技术领域近30年来最令人惊叹的发展成果，是将子代遗传学诊断提早至孕前的更早期产前诊断技术。在体外受精-胚胎移植（IVF-ET）技术基础上，通过对配子或胚胎进行活检后染色体和（或）基因学检测，诊断其遗传学物质是否存在单基因缺陷、非整倍体或染色体拷贝数异常等，选择无疾病胚胎植入子宫，从而获得健康的子代。传统的产前诊断技术如孕妇血清学检测、羊膜穿刺、绒毛膜取样等，最终虽可避免患儿出生，但反复流产、被迫终止妊娠给母体带来的生理及精神创伤不可小觑，随之而来的道德伦理冲突问题也不容忽视。而PGT可完美弥补这些缺陷，从源头阻断遗传病的垂直传递，被更多患者所接受，甚至成为了其唯一的选择。2017年，为便于医务人员、遗传检测实验室人员以及患者之间的有效沟通，在国际辅助生殖技术监控委员会（ICMART）的主导下，美国生殖医学学会（ASRM）等多个国际学术组织均建议统一使用“preimplantation genetic testing（PGT）”代替“preimplantation genetic diagnosis/screening（PGD/PGS）”，准确地描述现有“第三代试管婴儿”技术，并将其进一步细分为3类，分别为植入前单基因检测（PGT for monogenic defects，PGT-M）、染色体结构变异检测（PGT for structural rearrangements，PGT-SR）及非整倍体检测技术（PGT for aneuploidies，PGT-A）。大多数罕见病为单基因疾病，遵循孟德尔遗传定律，故又称为孟德尔疾病，主要有常染色体显性、常染色体隐性、X-连锁、Y-连锁遗传模式，可依靠PGT-M进行预测性诊断。2018年我国《胚胎植入前遗传学诊断/筛查技术专家共识》指出，基因水平的检测适用于经规范的临床咨询，明确具有单基因遗传病高风险的夫妇，如较为常见的纤维囊性病变、血红蛋白病、Huntington舞蹈病等等；PGT-M同样也适用于夫妻双方或之一携带有严重疾病遗传易感基因致病突变，如可致乳腺癌-卵巢癌综合征的BRCA1/2突变基因；另外，还可用于人类白细胞抗原（HLA）配型检测，挽救患有血液病如Fanconi贫血的同胞患儿。2003年人类基因组测序计划（human genome project，HGP）的完成，极大地推动了基因组医学的发展，确定了遗传病因的单基因疾病数量呈指数型增长。根据在线人类孟德尔遗传数据库（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）统计，截至2019年11月1日，已明确5472种孟德尔疾病共3792个致病基因。随着检测技术的进步，PGT-M适用范围已逐步扩展到De novo突变、或家系不完整的患者，从理论上讲，若能确定致病性基因变异的序列信息，PGT-M可应用于所有可被诊断的孟德尔疾病，防止其在家系内继续遗传，这无疑给众多被罕见病所困扰的家庭带来了希望。PGT-A则是在染色体层面进行检测，2011年为规范临床诊治流程，给患者提供更高质有效的诊疗服务，ESHRE 对PGT相关指南进行了修改补充，其中明确指出：PGT-A筛查范围不局限于特定致病遗传因素，指对早期胚胎的染色体数目非整倍性的情况进行检测，以挑选染色体数目正常的胚胎植入子宫，以期增加妊娠率而提高PGT周期效率，特别适用于高龄、不明原因反复移植失败、夫妇双方核型正常但有多次流产史等患者。然而，关于PGT-A是否确能提高妊娠率、能否真正获益，目前存在较大争议，仍需大量前瞻性随机对照试验进行验证。

2  PGT发展史上的里程碑

关于PGT的起源，追溯于50多年前Edwards提出关于PGT的设想，并利用荧光显微镜从受精后5d的兔囊胚中取出少量滋养外胚层细胞进行活检，通过分析X-染色质区分胚胎性别。1978年，世界首例“试管婴儿”Louise Brown的诞生，使PGT应用于人类成为了可能。受政治、宗教等社会因素以及PGT自身误诊风险的影响，PGT技术在很多国家和地区并不被法律所认可。直至1990年，Handyside团队首次对携带不同X-连锁隐性遗传病基因的两对夫妇，进行了卵裂球阶段的单细胞活检，通过聚合酶链式反应（PCR）扩增Y染色体特异DNA重复序列，筛选合适的胚胎性别并种植后顺利妊娠，1990年世界上首例经PGT的健康婴儿诞生标志其正式登上历史舞台。2年后，通过巢式PCR技术，Handyside团队成功对第7号染色体上突变的致病CFTR基因进行PGT-M检测，双方均携带有纤维囊性化致病基因变异的夫妇拥有了健康孩子。在基因组学、分子生物学、分子遗传学等多种新技术产生与成熟的基础上，PGT在20世纪90年代进入快速发展期。现如今，已有成千上万的孩子通过PGT健康地来到这个世界，其中超过2/3是通过PGT-A检测排除非整倍体的风险，1/3通过PGT-M与PGT-SR排除相关遗传性疾病。作为辅助生殖技术的主要进步之一，PGT现广泛应用于临床，离不开近30年来胚胎活检、胚胎冻存以及遗传学检测技术的不断创新与突破。

2.1    PGT活检技术    

获得可用于检测的胚胎遗传物质是进行PGT的基础。根据患者的不同情况，可选择不同阶段的PGT活检方法，目前主要包括极体、卵裂球与囊胚活检。

极体活检适用于未受精的卵母细胞或受精卵，可在最早期检测出相关母源性致病基因或染色体异常，最突出的短板在于无法检测父方的遗传缺陷。若出现染色体交叉互换，第一极体可能会同时携带正常与突变基因，这种情况下需进一步检测第二极体，才能较准确地间接推断卵母细胞遗传信息。卵裂球活检指在受精后3d的6～8细胞的卵裂球阶段获取1～2个细胞进行活检，应用较为广泛，主要局限性在于取材少，对胚胎损伤相对较大，移植率、妊娠率均降低，陆续也有实验证实2-细胞活检相比于单细胞活检，可降低约40%活产率。另外，卵裂球期嵌合体发生率可达30%甚至更高，因嵌合胚胎种植率低、流产率高，既往不建议移植，但2015年Greco等在NEJM首次报道嵌合胚胎成功妊娠，认为其中约1/3可发育为健康子代，对于卵巢功能低下的患者而言，放弃嵌合胚胎可能造成较大的损失。发育至5～6d的囊胚约含120个细胞，从其中抽取5～10个滋养外胚层细胞（trophectoderm，TE）进行活检，称为囊胚活检。优势在于取材量较充足，检测结果更可靠，对发育成胎儿部分的内胚层细胞团（Inner cell mass，ICM）无损害，更加安全，且一部分染色体异常的胚胎细胞可进行自我淘汰，囊胚嵌合体发生率约为10%，妊娠率也相应提高，成为越来越多患者的选择。近年，对囊胚腔液（blastocoel fluid，BF）及培养液中游离DNA的关注度日益增加，但目前很多研究显示BF或培养液中游离DNA 与TE的检测结果常不一致，推测与胚胎可能存在的自我修正机制，以及样本量过少、外源性DNA污染等因素相关。所以，寻找一种可靠的生物标志物是进行非侵入性PGT的关键挑战之一。

2.2    胚胎玻璃化冻存技术    

在胚胎冻存技术问世以前，被活检之后的胚胎均需在受精后第6天前移植入同步化的子宫，所有遗传检测结果要在此之前完成，繁重的工作量限制了PGT临床推广。2018年我国一项多中心随机对照试验表明，冻胚移植移植率、妊娠率、活产率与鲜胚移植无明显差异，并可有效降低卵巢过度刺激综合征风险。

除冻存胚胎外，玻璃化冻存技术还可广泛应用于保存干细胞、卵母细胞、卵巢、工程化组织等，大力推动了生育力的保存、组织工程治疗等领域的研究进展。人类成功妊娠第一枚经慢速程序化冷冻（slow freezing，SF）的胚胎报道于20世纪80年代，目前慢速程序化冷冻和玻璃化冻存在临床上均有使用。SF使用的冷冻保护剂（cryoprotectant agent，CPA）浓度相对较低，缓慢降温过程中仍难以避免冰晶的形成，对细胞各结构及组织造成不同程度的损伤，且对降温速率的精准程度有严苛的要求。减少这些损伤的关键在于提高冷冻速率与复温速率，具有超高降温速率的玻璃化冷冻技术应运而生，可显著减少冷冻过程中冰晶形成。为克服玻璃化所需高浓度CPA带来的细胞毒性等问题，研究人员发明了不同的载体如电子显微镜铜网、Cryoloop、Cryoto等，通过减小样本体积提高冷却速率。已有不少研究表明，经玻璃化冷冻的胚胎复苏率、种植率、妊娠率均高于慢冻法，样本类型、体积大小，CPA浓度、夫妻双方年龄等多种因素均可影响胚胎玻璃化冻存效果，冻胚移植的安全性以及复苏胚胎选择的优先级次序等诸多疑问尚无明确定论，仍需进一步的研究确定更为规范、安全、高效的胚胎冻存、复苏、移植程序。

2.3    PGT遗传物质检测技术    

面对与日俱增的临床需求，PGT核心检测技术的不断进步是其临床转化的关键。PGT检测技术总体上可分为基于核酸杂交的间接检测与核酸序列的直接测定，前者通过已知基因序列的探针对目标序列进行捕获检测，如ASO反向斑点杂交、荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH）等，后者是直接获得核酸序列信息的唯一手段，如第一代Sanger测序、第二代焦磷酸及高通量测序。1983年Kary Mullis发明了轰动世界的PCR技术，实现了DNA片段快速大量的扩增，极大地提高了产前诊断的效率［19］。最早的单细胞PCR技术在1990年首次应用于X-连锁肾上腺脑白质营养不良和X-连锁精神发育迟滞的胚胎植入前诊断，标志着PCR成为PGT-M重要的检测方法之一。PGT-A领域则有同为经典的FISH技术，现可用于快速检测诸多可能与染色体微缺失/微重复相关的出生缺陷疾病，如Prader-Willi综合征、Angelman综合征等等。

目前临床上常用的PGT单细胞遗传物质检测方法主要包括PCR、FISH、微阵列技术以及下一代测序技术。2004年，全基因组扩增（whole genome amplification，WGA）技术的发明克服了单细胞水平基因检测DNA模板量过少的问题，极大地提高了检测结果的准确性以及单细胞分析的可靠度，主要包括简并寡核苷酸引物PCR技术（DOP-PCR）、多重置换扩增（MDA）以及目前较为看好的单细胞全基因组扩增方法——多次退火环状循环扩增技术（Multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC），MALBAC可将样本起始量降至皮克级，有较高的扩增均一性和基因组覆盖率，可在一定程度上降低等位基因脱扣率。PGT-M的实施不仅依赖于DNA扩增技术的提高，还得益于DNA标记技术取得的长足进步。20世纪70年代末，Kan等学者利用最早第一代DNA标记技术RFLP（restriction fragment length polymorphism）对羊水穿刺获得的胎儿细胞DNA进行间接基因诊断，判断其是否带有镰刀细胞贫血症致病基因，这也是最早的产前诊断。第二代DNA标记技术为具高度多态性的短串联重复序列（short tandem repeats，STR），2006年Renwick等在利用MDA成功扩增49枚囊胚DNA的基础上，结合使用STRs连锁分析，开发出只需一组标志物可检测同种单基因疾病不同携带者的快捷高效检测方法，无需对特定突变进行个体化测试，并首次提出“胚胎植入前单体型分析（preimplantation genetic haplotyping，PGH）”体系，并完成了杜氏肌营养不良与囊性纤维化病变的基因检测。但STR在人类基因组中数量有限，分布不均匀，进行基于家系的靶向单体型分析时需对每个病例进行个体化设计，导致检测周期延长，效率较为低下，一定程度上限制了其在临床的广泛应用。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）的应用意味着第三代多态性标记时代的到来，SNP指由于单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，是拥有数目最多、分布最广的遗传标记，与微阵列基因芯片技术相结合，形成单核苷酸多态性微阵列（SNP array），与微阵列比较基因组杂交技术（array comparative genomic hybridization，aCGH）并驾齐驱，将PGT诊断精确度推上新的高度。众所周知，单细胞基因分析过程中无法回避的主要问题为等位基因脱扣（allele drop-out，ADO），即等位基因其中之一优势扩增，甚至另一个扩增完全失败，造成单核苷酸变异检测结果的假阳性或假阴性，是造成PGT-M误诊、可移植胚胎数目减少的重要因素之一，发生率可达10%左右。为尽量减少ADO、样本污染等因素的影响，现临床上常规推荐同时进行突变位点的直接检测与遗传多态位点（SNP/STR）连锁分析。近年来，基于SNP芯片的核型定位（karyomapping）技术逐渐兴起，可同时连锁分析父母和先证者（或已知疾病状态的参考个体）全基因组近30万个SNP位点，检测大量单基因疾病如马凡综合征、囊性纤维化等。Karyomapping可避免ADO的发生，检测成功率可高达95%。当SNP探针足够多时，Karyomapping还可识别一部分染色体的异常，包括减数分裂起源的多倍体、单亲二倍体或部分缺失，甚至染色体易位、重排等变化，为建立可同时检测单基因疾病及染色体异常的通用PGT体系提供了解决思路。1977年Sanger等以噬菌体为研究对象完成了世界上首次基因组测序，第一代Sanger测序法诞生，基因组学时代就此拉开序幕。单细胞WGA相关技术不断进步，推动着测序技术的更新换代，高通量测序技术（high-throughput sequencing，HTS）走进人们的视野，给PGT技术带来了革命性的改变。HTS也被称为下一代测序技术或二代测序（Next generation sequencing，NGS）技术，通过DNA文库制备、高通量测序、遗传检测数据的分析与解读，实现了一次性对上百万条DNA进行测序，不仅缩短了耗费时间，也将单碱基测序成本降至了最低，遗传性疾病的诊断率和分辨率迈入新的高度。以NGS为基础的主要技术包括全外显子组测序、目标区域重测序、全基因组重测序。全外显子组虽仅占全基因组的1%左右，但约有85%的疾病相关突变点位于外显子编码区，加之全基因组测序价格较为昂贵，因此基于NGS的全外显子组测序在临床应用更为广泛。2013年，Treff等对携带常染色体隐性疾病（Walker-Warburg综合征、囊性纤维化、家族性自律神经失调、X连锁低磷性佝偻病、神经纤维瘤）致病性变异的6对夫妇胚胎，进行囊胚活检、全基因组扩增及高通量测序，最终显示与qPCR为基础的检测结果完全一致。NGS与MALBAC技术相结合，建立了等位基因映射识别胚胎平衡易位携带状态技术（mapping allele with resolved carrier state，MaReCs），以区分染色体平衡结果携带者，阻断易位染色体向子代传递。如前文所述，虽核型定位可同时用于检测非整倍体与单基因突变，但实际操作上对于染色体拷贝数变异的检测仍存在分辨率不足，并且无法直接获得突变位点的相关信息。为突破这些难点，2015年，北京大学乔杰院士团队建立了基于NGS揭示等位基因突变的非整倍体测序与连锁分析方法（mutated allele revealed by sequencing with aneuploidy and linkage analyses，MARSALA），该方法对囊胚活检的细胞进行MALBAC全基因组扩增后，再通过PCR对目标基因的SNVs进行扩增富集，将两种扩增产物混合后进行低深度的NGS检测，可同时通过CNVs和SNVs分别检测非整倍体和单基因疾病，并进行了基于SNP的连锁分析，直接的突变位点检测避免了同源重组带来的误差。为确保结果的精准，研究者利用Sanger测序、aCGH、STR连锁分析对结果进行了进一步的验证，证实了MARSALA技术的可行性与检测精准程度。高通量、低成本使NGS在临床各个领域如肿瘤学、生殖医学、微生物学等备受青睐，与目标序列捕获技术相融合的目标序列捕获测序，目前已成为PGT领先技术之一，但NGS需对DNA进行片段化处理，测序反应读长较短，需对数据进行大规模拼接，后期的数据分析仍是难点。在Haplarithmisis算法基础上，将PGT-M、PGT-A与PGT-SR一体化的OnePGT研究正在进行，利用第三代测序技术长读长的优势建立单倍型。这些如浪潮般更替的新兴技术，终将帮助人们克服各类技术瓶颈，逐步建立PGT的终极解决方案。

3  国内罕见病研究现状及PGT成功阻断案例

以二代测序技术和基因芯片为代表的高通量技术，为罕见病的一级预防提供了更为可靠的技术平台。国内基于新一代测序技术的PGT阻断罕见病垂直遗传研究正不断积累经验，越来越多振奋人心的消息陆续被报道。2015年，乔杰院士团队通过在国际上首次建立的MARSALA技术，同时检测非整倍体与单基因疾病，成功阻断了一家族遗传性多发性骨软骨瘤病的传递，迎来了2名健康女婴的降临，2016年同一团队应用该技术也成功阻断了脊髓性肌萎缩症的家系遗传。同年，我国首例通过PGT检测的“无癌宝宝” 在中信湘雅生殖与遗传专科医院诞生，其家族性罕见病视网膜母细胞瘤致病基因的传递成功被阻断，开启了国内通过PGT助孕阻断肿瘤易感基因传递的新篇章（中国科学报，2015年9月25日）。2017年，上海国际和平妇幼保健院对1例患有由矮小同源盒基因（short stature homeobox containing gene，SHOX）杂合致病性变异引起的Leri-Weill软骨发育不良症的患者，通过第一、第二极体、囊胚活检的“序贯分析”检测方案，最大限度避免染色体重组、ADO的影响，完成胚胎的培养和筛查，世界首例通过PGT极体基因检测阻断马德隆畸形致病基因的健康儿于2018年9月顺利诞生（文滙报，2018年9月18日）。2019年3月，全球首例通过PGT阻断印记基因疾病Schaaf-Yang综合征的新生儿也降生于上海国际和平妇幼保健院，针对先后6次妊娠，3次产子均夭折的患者，通过PGT筛选出未携带MAGEL2基因相关变异的胚胎后进行移植，使罕见遗传病的梦魇在此家系从此消失（新民晚报，2019年3月21日）。2019年4月，全球首例通过PGT技术阻断先天性骨骼发育不良的新生儿在南京妇幼保健院诞生，此种疾病可导致患儿脊柱严重骨化、体节缺陷等，为bmper基因突变导致的一种DSD罕见常染色体隐性遗传病（中国江苏网，2019年7月8日）。目前，湖南中信湘雅生殖与遗传专科医院已完成263种罕见病的PGT检测，共涉及283个基因；上海国际和平妇幼保健院也已完成170余种罕见病的孕前诊断，成功阻断2000余例罕见病患儿的出生，包括无虹膜症、枫糖尿症、重症联合免疫缺陷等等，造福了万千家庭。近年来，我国政府及人民群众对于罕见病的关注度日益提升，2018年国家卫生健康委员会办公厅、妇幼司出台全国出生缺陷综合防治方案，总目标为构建覆盖城乡居民，涵盖婚前、孕前、孕期、新生儿和儿童各阶段的出生缺陷防治体系，以提高出生人口素质和儿童健康水平。2018年5月，我国《第一批罕见病目录》发布，纳入了21-羟化酶缺乏症等121种罕见病，并于2019年2月发布《罕见病诊疗指南》，从病因、流行病学到详细诊疗过程，均囊括在内。细胞分子遗传学技术的飞跃进步延伸了遗传学出生缺陷三级防控体系，高通量基因测序技术无疑是目前出生缺陷和罕见病最具社会经济效益的防治手段，真正实现了从源头阻断家族性遗传病，助力实施“健康中国”战略。

4  发展瓶颈与未来展望

目前，不管在国际还是在国内，罕见病都正在经历一个关键的转折阶段，从无人问津的“孤儿病”到相关诊疗指南的出台，从无药可治到不断有新药研发上市，从难以预测到可从源头阻断，每一点进步都来之不易。PGT技术犹如一道曙光，照亮了万千被罕见遗传病所折磨的家庭，但所有技术都有其局限性，一项技术的兴起与进步势必伴随着相当多的困难与险阻。从公众认知角度看，很多可能携带致病基因的夫妇自身并无检测意识，如何提高我国群众对遗传病的认识，在孕前推广扩展型携带者筛查，并与植入前胚胎检测技术相辅相成，仍是一道难题；从技术层面而言，克服单细胞基因扩增ADO现象一直以来都是PGT-M主要挑战之一，尽管检测体系在不断优化升级，但目前仍无法完全消除ADO现象。在当前依赖SNP单体型分析的PGT-M体系中，需加以思考如何更好地应对家系De novo突变、不完整家系、以及因近亲婚配存在大量同源区域或目的基因位于染色体末端或其所在区域本身覆盖的SNPs极少等特殊情况。在数据解读方面，目前我国临床仍缺少大量专业的、经验丰富的遗传咨询及检测结果的遗传解读人员。因基因测序行业发展迅速，人们对各种单基因疾病复杂发病机制的了解速度与疾病种类的增长速度不相匹配，加之现常用的人群基因数据库中东亚人群占比低下，大大增加了确定基因变异与相对应疾病因果关系的难度。PGT-M作为一种预测性诊断技术，胚胎选择的唯一依据是目标基因的检测结果。由于每一个临床决策都关乎一个生命的抉择，因此对检测到的变异进行致病性分析和临床意义分析是PGT-M流程中一个至关重要的工作，也是NGS时代进行PGT-M面临的最大挑战。合格的遗传解读需要分析人员对变异分类标准和权威指南有深入的理解，并具有熟练的应用数据库和知识库的能力和文献检索能力。当前关于PGT的其他研究热点还包括：胚胎活检、冷冻复苏的安全性及其对子代远期影响；减数分裂或有丝分裂来源的嵌合体对胚胎着床与胚胎发育潜能的影响尚不明确，该如何决定其去留；PGT-A是否确能提高妊娠率及活产率；如何开发更多高效便捷的PGT通用检测方法；如何给予患者正确的导向等等。另一技术性难题为如何建立基因测序数据存储、传输、计算与共享平台，克服目前普遍存在的数据碎片化和应用孤岛、共享困难等现象。令人欣喜的是，紧跟网络信息技术飞速发展的脚步，上海国际和平妇幼保健院已率先开始打造基于5G的基因诊断云服务平台，以实现基因测序数据的高效传输和跨机构、跨地域共享。胚胎植入前检测技术在我国的发展历程并不长，但未来对其需求必呈井喷式增长。在这个充满活力、不断创新的研究领域，在全国众多科研人员、医务工作者的共同不懈努力下，可期利用PGT精准阻断罕见遗传病，显著降低出生缺陷发生率，从根源上提高国民健康水平，切实造福更多民众，打造健康强国。（参考文献略）